一、實驗目的:利用hemolysis、catalase test、clumping factor test等實驗來區分出未知的4種GPC種類

二、實驗方法:分為七個部分。第一部分,確定菌種是否為pure culture;第二與第三部分鑑定staphylococcus;第四、第五、第六部分鑑定streptococcus;第七部分觀察各菌溶血的情形

1.Gram stain:確定菌種是否為pure culture,皆為陽性

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2.Catalase test:

(1)原理:細菌進行有氧呼吸會產生H2O2,若是細菌有catalase(觸媒)則可將其分解為H2O和O2。藉由此實驗來區分皆為Gram stain(+)的葡萄球菌與鏈球菌。

(2)材料:loop、玻片、洗瓶、3%H2O2、酒精燈、打火機

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(3)方法:

① 用滅菌過的loop分別沾取A、B、C、D四種在不含血的培養基培養的細菌塗抹至乾淨乾燥的玻片上

② 將3%H2O2滴至菌落上

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③ 觀察有無氣體(泡泡)產生

(4)結果:A(+)、B(+)、C(-)、D(-),A與B為球菌,C與D為鏈球菌

 

3.Clumping factor(slide coagulase) test

(1)原理:S.auresus有coagulase(凝固酶),會作用於plasma中的fibrinogen(纖維蛋白原),使其成為fibrin(纖維蛋白)產生凝塊。藉由觀察是否產生凝集可得知何者含有coagulase,進而區分出A、B菌何者為為S.auresus

(2)材料: coagulase plasma(rabbit plasma with EDTA)、dd water、loop、酒精燈、打火機、塑膠小試管、菌種:S. aureusS.epidermis

(3)方法:

*Slide method

① 滴一滴coagulase plasma在乾淨乾燥玻片上,另滴一滴大小一致的dd water在旁邊作為control

② 用滅菌過的loop沾取同量菌落,各自與coagulase plasma、dd water混合均勻

③ 看control來比對濁度,觀察有無凝集

*Direct tube method

① 用滅菌過的loop沾取菌落到加有200 µl coagulase plasma的塑膠小試管中

② 放置於37℃的incubator 4小時,再觀察是否凝固

(4)結果: 右邊為control

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結論:A菌為S.aureusB菌為S.epidermis

4. CAMP test:

(1)原理:group B streptococcus會製造一種稱為CAMP substance的胜肽,它會與β-hemolysis的細菌一起作用,加強溶血作用。此實驗利用S.aureus與未知的CD菌一同培養,觀察其溶血現象來判斷是否屬於group B streptococcus

(2)材料:BAPloop、酒精燈、打火機、菌種:S.pyogenes (group A)S.aglctae (group B)

(3)方法:

① 用滅菌過的loop沾取S.aureus在BAP中央畫一直線

② 在距離該直線5mm處畫一與其垂直的S.pyogenes

③ 在S.pyogenes 的另一邊(不要正對)畫一條S.aglctae

④ 在incubator培養24小時候觀察其溶血狀況

(4)結果: 因為不小心兩條線都畫成C菌,所以出現2個箭頭

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5.Bile-Esculin test:

(1)原理:Bile-Esculin  medium含有40%膽鹽、esculin、ferric citrate等,若細菌能在此medium存活,則其水解產物esculetin與鐵離子會形成棕黑色複合物。藉由此實驗可區分出CD菌何者為D群鏈球菌。

(2)材料: BEA agar、loop、酒精燈、打火機

(3)方法:

①用滅菌過的loop沾取CD菌以畫Z線的方式各自接種在BEA agar斜面上

②蓋子不完全鎖緊,置於incubator 24小時後觀察

(4)結果: 只有D菌的medium變成棕黑色

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結論:D菌為D群鏈球菌

6. Sodium chloride tolerance test:

(1)原理: 腸球菌有高度耐鹽性,能在高濃度食鹽之培養基中生長;培養基內含淡紫色酸鹼指示劑,若是細菌存活下來,其代謝產物會使pH值下降,菌液顏色會改變。此實驗可判斷CD菌何者為腸球菌。

(2)材料: 含酸鹼指示劑的6.5% NaCl broth、loop、酒精燈、打火機

(3)方法:

①用滅菌過的loop將CD菌各自接種在broth中

②置於incubator 24小時後觀察

(4)結果: 只有D變為黃色

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結論:D菌為腸球菌

7.Hemolysis型態

(1)原理: 藉由觀察溶血型態來分辨菌種

(2)材料: 待測菌、5%   sheep blood agar plate、loop、酒精燈、打火機

(3)方法: 將四種菌接種在BAP上培養overnight後觀察

(4)結果:

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三、總結: ’X’代表不須/未做該試驗

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四、 問題與討論:

A菌與B菌利用Catalase test與Slide coagulase test兩種實驗即鑑定出來;C菌與D菌用CAMP    test、Bile-Esculin test、NaCl tolerance     test三種實驗來做區別,雖然在CAMP test中誤將D菌塗成C菌,但D菌可由Bile-Esculin test得知屬於D群鏈球菌、NaCl tolerance     test得知屬於腸球菌,參照講義第23頁的表格可推論出它是S.faecalis enterococci

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