其實臨床實際上不會真的做到8管,實驗課練習才做了一整套~

 

〈氧化酶試驗(Spot Oxidase test―Kovac's Method〉

一、實驗目的: 測試未知的C菌和D菌是否擁有氧化酶,進而做其他實驗來鑑定。

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二、實驗原理: 能行有氧呼吸的細菌擁有細胞色素氧化酶(cytochrome oxidase),此酶會氧化實驗試劑(tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride ),產生indophenol,試劑顏色就會從淡黃色變成紫黑色,所以我們可藉由加入試劑後的顏色變化來得知細菌是否擁有氧化酶(不變色→陰性;變色→陽性)

三、實驗材料與器材:

1.菌種: 24hr培養未知的C菌和D菌、P.aeruginosa

2.器材: loop、打火機、酒精燈、agar plate、濾紙、tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD)、incubator

四、實驗方法:

1. 將三片濾紙分別做好標示

2. 用滅菌過的loop分別沾取C菌、D菌、綠膿桿菌塗至濾紙上

3. 滴上TMPD

4. 觀察10秒內顏色的變化

五、實驗結果:

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〈生化八管試驗〉

一、實驗目的: 腸內菌(Enterobacteriaceae)可分為許多屬,都是Gram stain(-),若要進一步區分就必須利用生化實驗來檢驗其代謝產物。每一生化實驗的結果都有其代碼,利用GFB-14E電腦密碼鑑定系統來查表,可得知擁有此一系列生化特性的菌可能的種類。

二、 實驗方法:總共有6個生化實驗,以下逐一描述,結果統一於最後總結 。

1. Triple Sugar Iron Agar (TSI  Agar test)

(1) 原理:此為定性實驗。TSI  Agar含有1% lactose、1% sucrose、0.1% glucose以及pH指示劑(phenol red),可觀察細菌利用醣類的情形;另含ferrous mmonia sulfate,用來測知細菌產硫化氫(H2S)的情形。

(2) 材料:TSI  agar  slant、needle、酒精燈、未知的C菌和D菌、incubator

(3)方法:

① 將tube標示好(TSI )

② 將needle過火滅菌,沾取菌落在slant表面畫蛇紋,再刺入2/3

③ 將tube鬆蓋,在incubator培養24hr後觀察變化

 

2. Citrate Utilization Test

(1)原理: Simmons citrate agar內含有檸檬酸與Bromothymol blue(酸鹼指示劑),若是細菌能夠利用檸檬酸,則會有鹼性副產物產生,培養基顏色將由綠轉藍。

(2)材料: Simmons citrate agarloop、酒精燈、未知的C菌和D菌、incubator

(3)方法:

① 將tube標示好(Cit)

② 將loop過火滅菌,沾取菌落在slant表面畫蛇紋

③ 在incubator培養24hr後觀察變化

 

3. Urease test

(1) 原理: 將細菌接種於含phenol red(酸鹼指示劑)urea broth medium中,若細菌擁有urease則會分解urea,產生ammonia,最後形成(NH4)2CO3,使pH升高,agar會變為桃紅色。

(2) 材料: urea agar、loop、酒精燈、未知的C菌和D菌、incubator

(3)方法:

① 將tube標示好(Ure)

② 將loop過火滅菌,沾取菌落在slant表面畫蛇紋

③ 在incubator培養24hr後觀察變化

 

4. Sulfide Indole Motility (SIM) test

(1) 原理: SIM agar內含有大量的tryptophan,為半固體培養基,可觀察細菌是否擁有tryptophanase和運動性。若細菌有tryptophanase,在培養24hr之後加入Kovac's reagent會和其代謝tryptophan產生的indole形成紅色複合物;若有運動性,則培養後會發現agar變混濁。

(2) 材料:SIM agar、Kovac's reagent、酒精燈、未知的C菌和D菌、incubator、dropper、needle

(3)方法:

① 將tube標示好(SIM)

② 將needle過火滅菌,沾取菌落垂直刺入2/3

③ 在incubator培養24hr後觀察有無IPA(棕色環)agar有無混濁

④ 紀錄完後加入10滴Kovac's reagent

⑤ 觀察有無變色

 

5. Voges-Proskauer test (VP test)

(1) 原理: pyruvate是發酵葡萄糖時產生的化合物,有的細菌會將pyruvate進一步代謝,產生acetoin;在正常大氣壓的含氧量下加入40%的KOH,acetoin會反應成diacetyl,再加入α-naphthol作為觸媒,會成為紅色複合物。

(2) 材料: MR-VP Broth or semisolid agar、6% α-naphthol、40%KOH、酒精燈、未知的C菌和D菌、incubator、dropper、needle

(3)方法:

① 將tube標示好(VP)

② 將needle過火滅菌,沾取菌落垂直接種數次

ya戳好戳滿來回抽插半固體的膠都快爛掉ㄌ

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③ 在incubator培養24hr後,加入12滴α-naphthol

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④ 再加入4KOH,稍微搖動混合

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⑤ 靜置15分鐘後觀察

 

6. Lysine decarboxylase test、Arginine dihydrolase test、Ornithine decarboxylase test

(1) 原理: 檢測菌種是否有此三種氨基酸酵素。此三管培養基中都含有bromcresol purple(酸鹼指示劑),若細菌擁有上述酵素,則會代謝出鹼性產物,使培養基變為紫色。

(2) 材料: Moller's   ornithine decarboxylase medium、Moller's    lysine decarboxylase medium、Moller's   arginine dihydrolase medium、酒精燈、未知的C菌和D菌、iincubator 、dropper、loop、礦物油

(3)方法:

① 將tube分別標示好(Lys、Arg、Orn)

② 將loop過火滅菌,沾取菌落分別接種於三支培養基

③加入2 ml礦物油使medium呈無氧狀態

④ 在incubator培養24hr後觀察

 

三、實驗結果:

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四、討論:

1. 在氧化酶試驗中,理論上是先滴試劑再塗菌,但由於怕動作不夠快,試劑會氧化,所以改成先塗菌再滴試劑。

2. 在氧化酶試驗中,綠膿桿菌作為陽性對照組,避免操作不當而造成的偽陰性。

3. 在TSI agar test中,H2S只會在酸性環境下產生,所以見到黑色應判斷為黃色,但Shewanella putrefaciens例外。

4. 在TSI agar test中,C(Salmonella spp.)agar呈紅色是因為Peptone(蛋白腖,用於微生物培養基中提供養分)代謝後產生鹼性化合物ammonia

5.在SIM test中,needle需垂直插入,拔出時也要照原軌跡,才容易觀察菌的運動性。


每次打開incubator 都可以聞到濃醇香(?)的細菌培養皿氣味

不戴口罩絕對不進實驗室(喂

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