冷雨敲窗

<細菌接種、分離與培養>

1.實驗目的： 微生物通常會與其他細菌混合再一起生長，為了要鑑別和了解個別微生物的特性，就必須單一培養細菌，就是所謂的”pure culture”。

2.實驗器材與試劑：agar plates、Loops、酒精燈、菌種：Staphylococcus aureus、 Escherichia coli的agar plate culture、打火機

3.實驗步驟： 使用平盤塗佈法( Four-way streak plate inoculation)

(1) 將Loop於酒精燈上燒紅(至少2/3以上)

(2) 等待冷卻後沾一點菌

冷卻的方法就是在沒有塗到菌的地方碰一下，讓培養基去幫忙降溫，確定不燙了再沾菌

(培養皿平常都是底部朝上，標記也寫在底部。底部朝上是為了避免水氣滴到菌落上)

這是血液培養基，所以滿鮮紅的

(3) 左手拿著plate(手掌撐在底部)，蓋子半開狀，右手持loop以z線來回畫至plate2/3處(要輕輕地不能把agar畫破)

(4) 重新燒紅Loop，冷卻後畫下一區(不用再去沾菌)，約與第一區重複3至5筆

在照片畫過的軌跡不太明顯

(5) 第三區與第四區畫完後拿到培養箱(37度/24小時，要倒過來放)

(6) 隔天拿出觀察

4.實驗結果：

Staphylococcus aureus(金黃色葡萄球菌)

Escherichia coli (大腸桿菌)

5.討論：

Staphylococcus aureus菌：大小約為 1mm的菌落，形狀為圓形，有一點點的微隆起，顏色為乳白色不透明， 質感看起來有點像白膠

Escherichia coli菌：大小約為2至3mm的菌落，形狀為圓形，有一點隆起，顏色較偏黃，不透明

(1)在進行平盤塗佈法，會不小心把agar塗破，因為角度太大導致，後來換了一盤plate再練習有改善。

(2)第一盤的Staphylococcus aureus菌，第四區沒有畫好，導致菌落沒有分很開，應該是空間沒有分配好，而且第三區和第四區交疊的筆劃數也太少。

(3)第二盤的Escherichia coli菌，分配空間較好，菌落比第一盤好觀察。

(4)在進行loop消毒時，要記得把plate的蓋子合起來，塗抹時也不要完全把 Plate打開，不然很容易汙染檢體。

<細菌抹片製作及Gram stain>

1.目的：細菌顏色通常是白色或是透明無色，沒有染色很難觀察，利用細菌的構造和特性染色，可以簡單並且迅速進行初步分類，是Gram stain最重要的方法。

2.材料：玻片、loop、needle、水、菌種：Staphylococcus aureus、Escherichia coli的agar  plate culture、crystal violet、Gram’s iodine、 alcohol 95%、Safranin、酒精燈、打火機、顯微鏡、濾紙

染色用的試劑由右至左(終於知道為什麼水槽會這麼繽紛了

3.方法：

(1)於玻片上滴一水，拿Loop分成2小滴

(2)使用needle過火消毒後，沾一點Staphylococcus aureus於水滴中，塗抹均勻後再進行消毒，換Escherichia coli同上述步驟

(3)等玻片完全乾燥，滴crystal violett反應1分鐘，沖洗玻片背面將多餘的染劑洗掉，以濾紙吸乾多餘水分

乾掉的樣子

不能用嘴巴吹，不然可能噴口水污染xd

滴上結晶紫(crystal violet)

水洗，要沖背面，沖正面就把所有染劑都沖掉了

沖到流下的水不再帶紫色就可以了

沖完後輕輕在濾紙上蓋一下，把水吸乾

(4)使用Gram iodine，同步驟3，再用alcohol 95%把藍色染劑洗掉(約12 至15秒)

滴上Gram iodine

再用酒精洗掉

(5)水沖玻片背面，濾紙輕輕壓乾，滴Safranin染45秒，水沖玻片背面

(6)玻片過火約3次直到水分蒸乾，於顯微鏡(油鏡)下觀察

4.實驗結果：

金黃色葡萄球菌

大腸桿菌

5.問題與討論： Escherichia coli為GNB，顏色紅色，大小約為2~3微米，隨意排列，通常是一隻隻桿菌分開

Staphylococcus aureus為GPC，顏色為藍紫色，大小約為1微米，排列成串，有時候可以看到單獨的1~2顆

(1)這次的實驗中，製作細菌片時要把水塗開，不然乾的很慢而且觀察時不好看，沾菌只要沾一點點就好。

(2)玻片進行過火時要小心不要被燙到。

(3)染色時盡量輕輕滴染色瓶，太大力會噴染劑。

(4)油鏡使用完後要用二甲苯擦乾淨。

(5)Staphylococcus aureus有些地方有點偏紅色，推測是因為Safranin染太久所導致。

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這次的報告是哈利鼠寫的，有取得哈利鼠同意才放的，我只有稍微加一些照片的說明，內容沒改動(但我有改錯字哈哈哈

感恩哈利鼠讚嘆哈利鼠<3